氡暴露致肺癌相關(guān)基因研究的進(jìn)展

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　　氡是地殼中的鈾的天然衰變產(chǎn)物，普遍存在于環(huán)境空氣中。近年來(lái)，隨著建筑材料的廣泛應(yīng)用，普通人群對(duì)氡的接觸機(jī)會(huì)和暴露水平明顯增加。主要的職業(yè)性氡接觸人群是鈾礦工。礦工吸入高濃度氡(222Rn)會(huì)增加患肺癌的危險(xiǎn)性。利用礦工模型的外推表明，氡是第二位致肺癌的因素。德國(guó)7%的肺癌、荷蘭4%的肺癌、瑞典4%的肺癌以及美國(guó)的10%～15%的肺癌由氡暴露引起。為了證明這些估計(jì)的可靠性，許多國(guó)家進(jìn)行了居室內(nèi)氡暴露與肺癌關(guān)系的流行病學(xué)研究。目前認(rèn)為居室氡暴露可能導(dǎo)致患肺癌的危險(xiǎn)性增加，主要根據(jù)從高濃度接觸氡礦工的研究結(jié)果的外推，尚缺乏直接的生物學(xué)證據(jù)和分子流行病學(xué)調(diào)查資料證實(shí)。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的發(fā)展，對(duì)肺癌基因的研究已較透徹，確定了許多與肺癌相關(guān)的基因，顯性基因如ras家族(H-ras、N-ras、K-ras)、myc家族(c-myc、Lmyc、N-myc)、erbB家族(erbB、1erbB2/Her~2/neu);隱性基因如p53基因、Chr3p、Chr5p13~5q14、Chr9p21~9q、視網(wǎng)膜母細(xì)胞田基因(Rb)，其他基因如raf基因(C-ral-Ⅰ)、jun家族(c-jun、junB)src家族(src、lck)、視黃酸受體基因(RARα、RARβ、RARγ)、磷酸酶(磷酸酪氨酸磷酸酶)等。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，人們陸續(xù)研究氡輻射致肺癌的相關(guān)基因，如p53、K-ras、p16、6-氧-甲基嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-MGMT)和hprt基因，試圖尋找氡致肺癌的特異性分子標(biāo)志物。

　　一、p53基因

　　p53基因發(fā)現(xiàn)于1979年，它位于17p13.1，是一個(gè)重要的腫瘤抑制基因，其編碼一種相對(duì)分子質(zhì)量為53000的磷酸化核蛋白，全長(zhǎng)20kb，由11個(gè)外顯子組成。P53分為野生型和突變型。正常組織細(xì)胞中，p53為野生型，參與細(xì)胞G0～G1期的負(fù)調(diào)節(jié)，從而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化，控制細(xì)胞增殖，抑制癌細(xì)胞生成;突變型p53基因抑制野生型p53的活性，破壞其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的負(fù)調(diào)控作用，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。在數(shù)種類型的肺癌中，都發(fā)現(xiàn)了p53基因的缺失、重排或突變。突變是非隨機(jī)的，多發(fā)生于外顯子5～8的4個(gè)高度保守區(qū)(117～142、171～181、234～258、270～286位氨基酸殘基)。

　　不同致癌物可留下其特殊印跡(fingerprint)。Taylor等在分析受高濃度氡輻射的礦工肺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，p53基因第7外顯子的249密碼子發(fā)生AGG(精氨酸)→ATG(甲硫氨酸)的顛換。他認(rèn)為此位點(diǎn)是輻射誘發(fā)肺癌的標(biāo)記物。但在其后多項(xiàng)研究都不支持有氡特異p53熱點(diǎn)突變的存在。Popp等在研究氡致肺癌p53突變圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，G→T顛換的p53突變?cè)陔北┞兑鸬姆伟┲杏卸嘁姡J(rèn)為p53基因只能是氡致肺癌早期突變基因，以前過(guò)度夸大了p53第3外顯子213位密碼子多態(tài)性在氡致肺癌中的作用。Yngveson等認(rèn)為居室內(nèi)氡暴露似乎與肺癌p53基因較高的突變率有關(guān)聯(lián)。夏英等報(bào)道，接觸氡在200～350Bq?m-3?a-1范圍內(nèi)的7例肺癌病例中，有5例發(fā)生了p53基因突變(p53基因突變還可能與肺癌患者的年齡及吸煙史有關(guān))。他們發(fā)現(xiàn)，有2個(gè)樣品出現(xiàn)G→A堿基顛換突變，突變位置分別為第8外顯子的273位密碼子和第5外顯子的141位密碼子;1個(gè)樣品在209位密碼子出現(xiàn)A→T轉(zhuǎn)換突變，編碼精氨酸被置換為終止密碼子。隨后他們應(yīng)用PCR擴(kuò)增、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)和mRNA差異顯示方法，從高氡暴露地區(qū)居民肺癌組織和正常肺組織中選出有表達(dá)差異的基因片段標(biāo)本進(jìn)行PCR-SSCP)電泳，結(jié)果呈陽(yáng)性。其中3例經(jīng)克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)有堿基置換。經(jīng)反向Northern blot雜交，將肺癌組織表達(dá)呈陽(yáng)性的片段而正常肺組織呈陰性的片段進(jìn)行克隆測(cè)序。結(jié)果7條差異片段經(jīng)克隆測(cè)序后，其中NA7與GenBankEST中的AI208667序列同源性達(dá)95%以上;NG2與5條基因序列同源性高達(dá)98%;CA1與任何已知基因片段的開放閱讀框架同源性都小于70%。人為CA1可能是一個(gè)新的差異基因片段。但其同腫瘤的相關(guān)性需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。楊梅英等以云南錫礦工肺癌切除的癌組織和正常肺組織為樣品，用差異顯示法比較兩種組織差異表達(dá)基因，并將其克隆測(cè)序。結(jié)果在同一患者的肺癌組織和正常肺組織中發(fā)現(xiàn)有30個(gè)表達(dá)差異的基因片段。其中，16個(gè)片段僅在肺癌組織中表達(dá)而不在正常組織中表達(dá);14個(gè)片段僅在正常組織中表達(dá)而不在肺癌組織中表達(dá)。測(cè)定了6個(gè)片段的序列，CG2、CG7、CG8、CA5和C C等65個(gè)序列在GenBank中未查到有75%同源的序列，被認(rèn)為是新序列，并在GenBank中登錄;CG3與人核糖蛋白127a有95%的同源性。

　　Schneider等研究發(fā)現(xiàn)，原癌基因表皮生長(zhǎng)因子受體EGF-R、P53蛋白和P53抗體可在一些氡暴露致肺癌患者中檢測(cè)到。這些表達(dá)產(chǎn)物可以能過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)，所以可作為分子標(biāo)志物用于氡致肺癌的分子流行病學(xué)調(diào)查。但他們未發(fā)現(xiàn)這些表達(dá)產(chǎn)物在不同肺癌的病理組織學(xué)類型、不同年齡、不同暴露程度的肺癌患者血清中有明顯升高或降低的現(xiàn)象，所以限制了這3種表達(dá)產(chǎn)物作為常規(guī)的生物標(biāo)志物在氡致肺癌分子流行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用。Lutz等述及p53基因突變和表達(dá)異常產(chǎn)物可作為氡致肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程的基礎(chǔ)，同樣都可作為監(jiān)測(cè)基因操作和蛋白合成的分子標(biāo)志物用于流行病學(xué)調(diào)查中。p53基因發(fā)生突變是癌癥發(fā)展中的必需過(guò)程，p53基因的表達(dá)異常和基因突變也引起細(xì)胞內(nèi)P53蛋白水平改變，細(xì)胞外液和血液中的P53蛋白水平隨之升高。所以血液中血清蛋白P53水平的升高可作為肺癌早期診斷指標(biāo)。大量的研究結(jié)果表明，隨著變異型和野生型的P53蛋白的增加，P53抗體相繼產(chǎn)生。統(tǒng)計(jì)分析表明，P53抗體可認(rèn)為是癌癥發(fā)展中特異性的生物標(biāo)志物，其水平的升高與p53基因的突變頻率及癌癥的惡化程度有關(guān)。

　　二、K-ras基因

　　K-ras基因位于第6和第12號(hào)染色體上，屬ras基因家族。Ras基因是原始保守的基因。Ras家族編碼相對(duì)分子質(zhì)量21000的GTP/GDP結(jié)合蛋白P21。P21蛋白與G蛋白有關(guān)，在細(xì)胞生長(zhǎng)刺激信號(hào)的傳遞和細(xì)胞生產(chǎn)調(diào)節(jié)中起作用。P21接受其上游信號(hào)分子傳遞的生長(zhǎng)與分化信號(hào)，通過(guò)下游效應(yīng)分子控制細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。Ras基因激活機(jī)制有三：(1)點(diǎn)突變。最終有利于P21蛋白與GDP結(jié)合，導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂。K-ras基因在第12位 密碼子發(fā)生點(diǎn)突變。(2)基因過(guò)表達(dá)。由基因擴(kuò)增(如肺癌中的K-ras基因擴(kuò)增)或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)引起。(3)基因插入、轉(zhuǎn)位。可導(dǎo)致基因有過(guò)表達(dá)而活化。Ras基因激活導(dǎo)致ras-P21過(guò)量生成，持續(xù)將生長(zhǎng)信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞轉(zhuǎn)化或惡變。K-ras基因突變率越高，腫瘤進(jìn)展越快。

　　在K-ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，外顯子1在密碼子12或61發(fā)生點(diǎn)突變，產(chǎn)生突變的ras蛋白與GTP結(jié)合牢固，中斷GTP與GDP循環(huán)，給細(xì)胞生長(zhǎng)傳遞連續(xù)的有絲分裂信號(hào)，使細(xì)胞從分化狀態(tài)轉(zhuǎn)為增殖狀態(tài)，活化的ras蛋白還延長(zhǎng)了細(xì)胞表面酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體信號(hào)存在時(shí)間，促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而引起肺癌。但在許多氡暴露致肺癌的流行病學(xué)調(diào)查中都未發(fā)現(xiàn)K-ras基因的突變，此過(guò)程可能缺乏突變的ras蛋白介導(dǎo)。

　　三、p16基因

　　p16基因是一種抑癌基因，位于9p21，全長(zhǎng)8.5kb，由2個(gè)內(nèi)含子間隔3個(gè)外顯子組成，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為16000的核磷蛋白p16。該蛋白包含一個(gè)148個(gè)氨基酸的開放閱讀框架，并由4個(gè)回鉤狀重復(fù)序列組成其空間構(gòu)型。這一構(gòu)型為維持p16活性所必需。p16是CDK4和CDK6的抑制劑。p16的主要作用在于能夠抑制CDK4/CDK6介導(dǎo)的Rb基因蛋白產(chǎn)物的磷酸化。磷酸化的Rb則無(wú)活性。在G1期，Cyclin D-CDK4復(fù)合物具有激酶活力，促進(jìn)Rb的磷酸化。而p16與Cyclin D競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK4，從而抑制Rb磷酸化，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。正常情況下，G1期CDK活性的增加使Rb失活，導(dǎo)致E2F過(guò)度表達(dá)，并誘導(dǎo)p16相關(guān)的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。因此，p16與Cyclin D、CDK4、Rb形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。p16的失活將導(dǎo)致細(xì)胞的過(guò)度增殖。

　　p16點(diǎn)突變較常見于各種類型的癌癥中。在氡暴露致肺癌的過(guò)程中，p16腫瘤抑制基因的失活和甲基化起著重要作用。Gilliland等對(duì)70名鈾礦工的外周血淋巴細(xì)胞DNA用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法進(jìn)行了NADPH醌氧化還原酶(NQO)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)GSTP1、GSTM及XRCC1基因多態(tài)性分析，并對(duì)從細(xì)胞中分離的DNA 用甲基化特異性PCR法分析p16的甲基化，發(fā)現(xiàn)GSTP1和104bpA至G位點(diǎn)的多態(tài)性增加了p16甲基化的危險(xiǎn)(OR=4.8，95%CI=1.3~14.2)。

　　四、O6-MGMT基因

　　人MGMT(hMGMT)基因位于第10號(hào)染色體26q上，含有5個(gè)外顯因子、4個(gè)內(nèi)含子。堿基組成比例為：A174、C231、G271、T159。啟動(dòng)子區(qū)富含G、C堿基，MGMT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(MEBP)與MGMT的增強(qiáng)子結(jié)合，上調(diào)MGMT表達(dá)。MGMT有基因多態(tài)現(xiàn)象。從大腸菌群到人類細(xì)胞系均發(fā)現(xiàn)有MGMT蛋白，為單肽結(jié)構(gòu)。MGMT是DNA修復(fù)酶，它是嘌呤甲